Der Film beginnt damit, dass Polizisten versuchen, eine junge Frau festzunehmen. Sie kann jedoch durch scheinbar übernatürliche Kräfte – extrem schnelle Kampfbewegungen – entkommen. Bei ihrer Flucht wird sie von mit der Polizei zusammenarbeitenden „Agenten“ in grauen Anzügen verfolgt, die ähnliche Fähigkeiten wie sie haben. Die Frau flüchtet in eine Telefonzelle, die einen Moment später von einem Agenten mit einem Lkw zerquetscht wird. Sie ist jedoch nicht in den Trümmern zu finden.

Der Paläontologe Dr. Alan Grant wird von dem vermeintlich reichen Ehepaar Kirby dazu überredet, sie bei einem Rundflug über Isla Sorna, die Insel der Dinosaurier, als Führer zu begleiten. Beim Anflug auf die Insel wird Dr. Grant mit einem Hieb von hinten bewusstlos geschlagen, nachdem er sich in eine Diskussion mit den Kirbys eingelassen hat, die auf der Insel landen wollten, obwohl Dr. Grant davon dringend abgeraten hatte.

Die Handlung beginnt kurze Zeit nach dem Ende des ersten Films. Neo, der sich nun seiner Kräfte bewusst ist, zweifelt immer noch daran, der Auserwählte zu sein. Derweil bereiten sich die Maschinen darauf vor, Zion, die Stadt der Menschen, einzunehmen. Im weiteren Verlauf der Geschichte begibt sich die Besatzung der Nebukadnezar auf den Weg nach Zion, um die dortige Bevölkerung auf den bevorstehenden Krieg einzuschwören und um den Ältestenrat von einer Gegeninitiative zu überzeugen. Gegen den Willen des obersten Zuständigen für die Verteidigung von Zion, Commander Lock, bekommt Morpheus die Erlaubnis des Ältestenrates für seine Gegeninitiative. Ihm schließen sich die Mannschaften zweier weiterer Schiffe an. Die Handlung splittet sich hier in zwei Stränge, wobei einer innerhalb der Matrix spielt und einer in der realen Welt.

Die Handlung schließt unmittelbar an das Ende von Matrix Reloaded an: Neo liegt ohnmächtig an Bord des Hovercrafts Hammer. Nachdem er mehrere Wächter ausgeschaltet hatte, fiel er scheinbar in ein Koma. Jedoch gleichen die bei ihm gemessenen Gehirnaktivitäten nicht denen eines Menschen im Koma, sondern einer Person, die sich in die Matrix eingeklinkt hat. Bane, der einzige Überlebende aus der vorausgegangenen Schlacht gegen die Maschinen, befindet sich ebenfalls ohnmächtig an Bord. In Matrix Reloaded wurde Bane von Smith überschrieben, während er seinen Rücktransfer aus der Matrix einleitete, wodurch Smiths „Geist“ – anstelle von Banes – in dessen Körper zurücktransferiert wurde.