Ein außerirdischer, verrückter Wissenschaftler, Dr. Jumba Jookiba, wird wegen der Durchführung von illegalen genetischen Experimenten und dem Erschaffen von Kreaturen, die Chaos und Zerstörung anrichten sollen, ins Gefängnis gesperrt. Sein jüngstes Experiment ist Nummer 626: ein kleiner, blauer Außerirdischer, der stärker, schneller, intelligenter und zerstörerischer ist, als es den Anschein hat. Auf seinem Weg zu einer Strafkolonie entkommt 626 durch eine Bruchlandung auf einer kleinen hawaiianischen Insel auf der Erde. Er tarnt sich als Hund und wird von einem kleinen Mädchen namens Lilo adoptiert, die mit ihrer Schwester Nani zusammenlebt, nachdem ihre Eltern bei einem Autounfall ums Leben gekommen sind. Lilo ist einsam und eine Art Außenseiterin, bis sie in 626 einen neuen Freund findet, den sie Stitch nennt.

Der Protagonist „Randale-Ralph“ ist nach 30 Jahren unzufrieden mit seiner Rolle als Bösewicht in dem 8-Bit-Ära-Arcade-Spiel „Fix-It Felix Jr.“,[4] da er auch nach Feierabend von den übrigen Charakteren ausgegrenzt wird. Nach einem Treffen der Selbsthilfegruppe „Anonyme Bösewichte“ innerhalb des Pacman-Labyrinths trifft er in dem Barkeeper-Spiel Tapper einen ausgebrannten Soldaten aus dem Ego-Shooter Hero’s Duty. Er schmuggelt sich in das fremde Science-Fiction-Spiel, um die eigentlich für den Spieler vorgesehene Heldenmedaille zu ergattern und damit Felix und die anderen Charaktere zu beeindrucken. Zunächst überwältigt von der düsteren Umgebung und der hektischen Spielemechanik, klettert er in einer Spielepause den zu erstürmenden Turm hinauf und nimmt die Heldenmedaille entgegen, die ihm von holographischen Militärs in Ehrenformation überreicht wird.

In einer von anthropomorphen Säugetieren bewohnten Welt erfüllt Judy Hopps aus dem ländlichen Dorf Bunnyborrow in Nageria ihren Traum, als erster Hase Polizist zu werden. Nachdem sie als Jahrgangsbeste in der Polizeiakademie abschließt, wird sie vom Bürgermeister Leodore Lionheart, einem Löwen, als neues Mitglied des Zoomania Police Departement (ZPD) vorgestellt. Polizeichief Bogo, ein Büffel, teilt sie jedoch nicht für die gegenwärtigen Untersuchungen von 14 vermissten Säugetieren ein, sondern als Politesse, da er an ihrem Potenzial, eine echte Polizistin zu sein, zweifelt. Während einer ihrer Schichten trifft sie auf den Fuchs und Trickbetrüger Nick Wilde.

Als der Betreiber der Spielothek, in der die Spielefiguren Ralph und Vanellope leben, nach Jahren wieder ein neues Gerät anschließt, entpuppt sich dieses als ein Internet-Router. Dieser ist allerdings anfangs noch nicht aktiv, da der Zugang zum neuen Gerät verboten ist. Vanellope, die seit den Ereignissen von Ralph reichts immer in ihrem Spiel gewinnt, wünscht sich neue Herausforderungen, also gestaltet Ralph ihr einen neuen Parcours. Als sie ihn ausprobieren will, ist das Mädchen, das gerade mit ihr spielt, nicht begeistert und versucht, sie auf die eigentliche Strecke zurückzubringen, wobei das Lenkrad des Spielautomatens zerstört wird. Da der Hersteller des Spieles nicht mehr existiert, suchen die gerade in der Spielothek anwesenden Kinder mit ihren Smartphones nach dem Lenkrad und finden eines, das gerade auf eBay angeboten wird.