Der Superschurke Gru lebt inmitten einer wunderschönen Vorstadtidylle. Seine Lieblingsbeschäftigung ist es, der Menschheit den Tag zu vermiesen. Sein schwarzes Haus und der verödete Rasen davor sind leicht zwischen den anderen gepflegten Häusern zu erkennen. Sein wahres Reich verbirgt sich jedoch tief unter seinem Haus in einer weit verzweigten Geheimfestung. Umgeben von einer Armee von Minions, seinen gelben kleinen Untergebenen, schmiedet der Hausherr hier seine weltweiten Schurkenstreiche, deren Krönung der Diebstahl des Mondes werden soll. Mit diesem Streich will er auch sein Lebensziel erreichen: Dass seine Mutter stolz auf ihn ist.

Ein geheimes Labor in der Arktis wird von einem mysteriösen Flugapparat mit einem riesigen Magneten gestohlen. Die Geheimorganisation „Anti-Verbrecher-Liga“ (AVL) will verhindern, dass das mit dem Labor entwendete Serum PX-41, die jede Lebensform in aggressive violette Fressmaschinen verwandelt, in die falschen Hände gerät. Der ehemalige Superschurke Gru lebt in seiner Villa ein ruhiges Leben mit seinen drei Adoptivtöchtern Margo, Edith und Agnes sowie mit zahlreichen Minions, seinen kleinen, gelben Helfern. Sein Leben nimmt eine plötzliche Wendung, als die quirlige Agentin Lucy Wilde ihn entführt und ins Hauptquartier der AVL bringt. Dort bittet ihn der AVL-Direktor Silas Ramspopo darum, sie bei der Suche nach dem Dieb des PX-41 Serum zu unterstützen.

Gru und Lucy versuchen Balthazar Bratt – einen ehemaligen, geistig in den 1980ern hängengebliebenen Kinderstar einer damals erfolgreichen Fernsehsendung – aufzuhalten, einen riesigen rosafarbenen Diamanten zu stehlen. Balthazar hasst die Welt und vor allem Hollywood dafür, dass seine Serie „Bösewicht Bratt“ abgesetzt wurde. Daraufhin hat er sich einen finsteren Plan ausgedacht, der ihm am Ende die Weltherrschaft sichern soll, damit er nie wieder von anderen ausgelacht wird. Gru und Lucy werden jedoch, nachdem sie den Diebstahl zwar verhindern, Balthazar aber nicht festnehmen haben können, von der neuen Leiterin der AVL (Anti-Verbrecher-Liga) Valerie Da Vinci gekündigt. Balthazar gelingt es daraufhin in Verkleidung, den riesigen rosa Diamanten zu stehlen.