Es ist das Jahr 1805, die napoleonischen Kriege sind längst losgebrochen und die französische Marine ist eine ernsthafte Bedrohung für die Flotte seiner

Der geschiedene Englischlehrer und Weinliebhaber Miles, der drei Jahre lang an einem Roman geschrieben hat, und sein bester Freund Jack, der sich als Schauspieler für Werbespots über Wasser hält und dabei von einer längst abgesetzten Serienrolle zehrt, unternehmen eine einwöchige Reise in die Weinanbaugebiete Kaliforniens nach Santa Ynez Valley. Beide kennen sich seit ihrer Zeit an der Universität von San Diego. Miles plant, von einem Weinberg zum nächsten zu fahren, ausgiebige Weinproben zu genießen, über Wein zu philosophieren, gut zu essen und Golf zu spielen. Jack will nach der Reise seine wohlhabende armenische Freundin heiraten und dann in das Immobilienmaklerbüro seines Schwiegervaters einsteigen. Er möchte sich auf der Reise vergnügen und vor der Hochzeit noch ein paar Abenteuer mit Frauen haben.

Der erfolglose Träumer Larry Daley lebt in New York City. Seine geschiedene Frau Erica droht, er werde den gemeinsamen Sohn Nick nicht mehr sehen können, wenn er weiterhin ein ungeregeltes Leben führen sollte. Deshalb nimmt er eine Stelle als Nachtwächter im Museum of Natural History an und glaubt, einen leichten Job gefunden zu haben. Da die Geschäfte des Museums schlecht laufen, werden Stellen abgebaut und die bisherigen drei bereits älteren Nachtwächter Cecil, Gus und Reginald entlassen. Noch vor dem Antritt seiner ersten Nachtschicht erhält Larry von den ehemaligen Wachleuten ein Handbuch und ihren Rat, unbedingt „die Regeln zu lesen“. Seine Aufgabe als Nachtwächter sei es, niemanden ins Museum hereinzulassen − jedoch auch niemanden hinaus.

Larry Daley, vormals Nachtwächter des Naturhistorischen Museums, ist mittlerweile ein reicher Unternehmer geworden. Alle paar Monate besucht er sein altes Museum. Bei einem dieser Besuche muss Larry feststellen, dass die Exponate durch Hologramme und neue Technologien ersetzt werden sollen. Die Exponate kommen in das US-Nationalarchiv in Washington, D.C. Dort können sie ohne die goldene Tafel des Pharaos Ahkmenrah nicht mehr zum Leben erwachen. So denkt Larry. Doch am folgenden Abend wird er von Jedediah aus dem Umzugscontainer heraus angerufen: Durch den diebischen Kapuzineraffen Dexter ist auch die Tafel von Ahkmenrah, die die Figuren nachts zum Leben erweckt, mit nach Washington gekommen. Nun steht das komplette Smithsonian-Institut dort in der Nacht Kopf. Der Pharao Kahmunrah, Ahkmenrahs älterer böser Bruder, will die Tafel in seinen Besitz bringen, um eine Armee aus der Unterwelt zu holen und die Welt zu erobern.

Im New Yorker American Museum of Natural History wird anlässlich der Eröffnung des Planetariums eine Show mit den zum Leben erwachten Exponaten aufgeführt. Nach kurzer Zeit verhalten sich die Figuren seltsam und lösen ein Chaos während der Show aus. Aufgrund dieser Katastrophe muss der Museumsdirektor seinen Stuhl räumen. Der Museumsnachtwächter Larry Daley findet heraus, dass die Tafel des Ahkmenrah, die die Exponate allnächtlich zum Leben erweckt, eine „Fehlfunktion“ hat. In der Hoffnung, dass Ahkmenrahs Eltern, die im Londoner British Museum ausgestellt sind, helfen können, reist Daley mit der Tafel und einigen Freunden sowie seinem Sohn Nick nach London.

Der Film folgt dem Leben von Paul Safranek und seiner Ehefrau Audrey. Der einfach gestrickte und gutmütige Physiotherapeut aus Omaha träumt mit seiner Frau von einem besseren Leben. Als auf der Erde eine Krise der Überbevölkerung einsetzt, gelingt es norwegischen Wissenschaftlern, ein radikales Verfahren („zellulare Miniaturisierung“[4]) zu entwickeln, mit dem sie die Menschheit auf eine Körpergröße von fünf Zoll (12,7 cm) schrumpfen lassen können. Auf diese Weise lassen sich zudem die Lebenshaltungskosten enorm senken. Von den Verlockungen eines verschwenderischen Lebensstils träumend, beschließen Paul und Audrey, sich der kontroversen Behandlungsmethode zu unterziehen.[2][5] Audrey macht jedoch kurz vor der Behandlung einen Rückzieher und Paul wird alleine geschrumpft.