Im Jahr 1942, während des Zweiten Weltkriegs, dringen Soldaten der Organisation „Hydra“, der Wissenschaftsdivision des Dritten Reichs, in die norwegische Stadt Tønsberg ein. In einem Kloster findet Johann Schmidt, Hydras Befehlshaber, ein mysteriöses, würfelförmiges Artefakt, das er als „Tesserakt“ bezeichnet. Dem Wissenschaftler Arnim Zola gelingt es, die Energien des Würfels zu bändigen und als Quelle für neuartige Energiewaffen zu nutzen.

In einer geheimen Forschungsanlage mit dem Namen Projekt Pegasus arbeitet die Organisation S.H.I.E.L.D. daran, den Tesserakt (siehe Captain America: The First Avenger) als eine unerschöpfliche Energiequelle einzusetzen. Allerdings ist der aus Asgard stammende Würfel auch ein interdimensionaler Portalöffner, und eine außerirdische Macht, die Chitauri, will damit die Erde erobern. Zu diesem Zweck haben sie ein Bündnis mit dem Asen Loki geschlossen, der die Geheimnisse des Würfels kennt (siehe Thor). Mit seinem Zepter öffnet Loki durch den Tesserakt ein Portal im Inneren von Projekt Pegasus, dringt in die Anlage ein und bringt nach kurzem Kampf einige Mitarbeiter des Projekts um Dr. Selvig und den S.H.I.E.L.D.-Spezialagenten Clint Barton (Hawkeye) durch Gedankenkontrolle in seine Gewalt. Mit deren Hilfe nimmt er den Tesserakt an sich und flüchtet aus der Anlage, die daraufhin durch das instabil gewordene Portal komplett zerstört wird.

Nach seiner Erweckung aus dem fast 70-jährigen Kälteschlaf und dem Kampf mit den Avengers gegen Loki hat sich Steve Rogers, alias Captain America, etwas mehr der modernen Zeit geöffnet, doch es fällt ihm immer noch schwer, mit der ihm fremden Welt und ihren veränderten Wertvorstellungen Schritt zu halten. Selbst seine alte Freundin Peggy Carter, inzwischen sichtlich gealtert und als einzige von seinen alten Kampfgefährten noch am Leben, kann ihm nur wenig Unterstützung geben. Beim Ausdauertraining am Lincoln Memorial freundet Rogers sich mit Sam Wilson an, einem ehemaligen Fallschirmjäger und jetzigen psychologischen Berater für traumatisierte Kriegsveteranen.

In der (fiktiven) osteuropäischen Stadt Sokovia kämpfen sich die Avengers durch die Armee von Baron von Strucker, um Lokis Zepter zu bergen, welches Hydra nach der Auflösung von S.H.I.E.L.D. in die Hände gefallen ist. Von Strucker wird von den Avengers gefangen genommen. Im Keller seiner Festung entdeckt Tony Stark eine versteckte Roboterfabrik. Die Zwillinge Pietro und Wanda Maximoff, die beide durch von Strucker mit Superkräften ausgestattet worden sind, halten sich ebenfalls im Gebäude auf. Wanda gelingt es unbemerkt, ihre psychischen Kräfte bei Stark spielen zu lassen, woraufhin er in einer Vision hilflos den Tod seiner Teamgefährten und die Zerstörung der Erde durch außerirdische Invasoren miterleben muss.

Der Film öffnet mit einem Rückblick auf den 16. Dezember 1991, an welchem eine geheime HYDRA-Basis in Sibirien geöffnet und der dort darin in Cryostasis ruhende Winter Soldier für eine Mission reaktiviert wird. In Folge dieses Auftrags drängt er einen Wagen von einer Waldstraße ab, bringt dessen Insassen um und nimmt eine Ladung von Präparaten an sich, die in diesem Fahrzeug transportiert wurden.

Die siebenjährige Mary wird von ihrem Onkel Frank großgezogen. Sie mag ihre einäugige Katze Fred und versteht sich sehr gut mit der Nachbarin Roberta, die öfter auf sie aufpasst. Ihre Mutter Diane beging kurz nach Marys Geburt Suizid. Sie war Mathematikerin und stand, so scheint es zunächst, kurz vor der Lösung des Navier-Stokes-Problems, eines der sogenannten Millennium-Probleme. Auch Mary ist überaus intelligent. Obwohl Frank sich ihrer Hochbegabung bewusst ist, möchte er, dass sie eine normale Kindheit erlebt und gleichaltrige Freunde gewinnt. Deshalb geht sie in die örtliche Grundschule, wo sie gleich am ersten Tag durch das mühelose Lösen komplizierter Rechenaufgaben auffällt.

Der in New York lebende, 15-jährige Peter Parker ist wie sein bester Freund Ned ein Außenseiter an der New Yorker Midtown High School. Einer der wenigen Lichtblicke an seiner Schule ist sein heimlicher Schwarm Liz, die Präsidentin des akademischen Zehnkampfteams dort, dem auch Peter angehört. Peter kann sich nur schwer auf den Unterricht und seine früheren Hobbys konzentrieren, weil er immerzu an die Geschehnisse in Deutschland denkt und sich Szenen des Kampfes auf seinem Laptop anschaut. Nachdem er als Spider-Man an der Seite von Tony Stark als Iron Man am Leipziger Flughafen gegen Captain Americas aufsässige Avengers vorgegangen war, hinterließ ihm Tony einen neuen Hightech-Spider-Man-Anzug, dessen viele Funktionen Peter nach und nach entdecken muss.

Das Raumschiff der Asen, in dem sich Thor, sein Bruder Loki, Bruce Banner und Heimdall befinden, wurde angegriffen. Der Titan Thanos tötete die Hälfte der Asen und ließ die andere Hälfte fliehen. Er foltert nun Thor und droht ihn zu töten, sollte ihm Loki nicht den Raumstein aushändigen. Loki beugt sich und gibt ihm den Tesserakt, in dem sich der Stein befindet. Thor und Hulk gelingt es nicht, Thanos daran zu hindern, mit dem Stein zu entkommen. Daraufhin tötet Thanos sowohl Heimdall, der aber Hulk zuvor noch mit dem Bifröst zur Erde teleportieren kann, als auch Loki, der zuvor vergeblich versucht hat, ihn zu überlisten. Der Raumstein ist der zweite Infinity-Stein, den der Titan in seinen Besitz bringen kann. Den ersten, den Machtstein, hat er bereits vom xandarianischen Nova Corps gestohlen, wobei er die Hälfte der Xandarianer getötet hat. Er schickt seine vier Ziehkinder Cull Obsidian, Ebony Maw, Corvus Glaive und Proxima Midnight nach zwei weiteren Steinen aus, die sich auf der Erde befinden. Daraufhin zer

Nach der Dezimierung durch Thanos befinden sich Tony und Nebula im Schiff der Guardians, der Benatar, auf dem Rückweg zur Erde. Tonys Verletzungen konnten von Nebula versorgt werden, doch nach wenigen Wochen versagt der Antrieb des Schiffes, sie treiben fernab jedweder Zivilisation durchs All und die Nahrungsvorräte und der Sauerstoff gehen zu Neige. Den sicheren Tod vor Augen nimmt Tony mit seinem Iron-Man-Helm eine Abschiedsbotschaft für Pepper auf, wird aber wenig später durch die von der Erde ausgesandte Captain Marvel gerettet. Diese bringt das Schiff sicher zum Avengers-Hauptquartier, wo der völlig abgemagerte Tony und Nebula von Pepper, Steve, Rhodey, Natasha, Thor, Rocket und Bruce empfangen werden.

Der erfolgreiche Krimiautor Harlan Thrombey wird am Morgen nach seinem 85. Geburtstag von seiner Haushälterin Fran in seinem Zimmer tot aufgefunden. Obwohl die Behörden offiziell von einem Suizid ausgehen, befragen die Polizisten Elliot und Wagner die verbliebenen Familienmitglieder, um letzte Fragen zu klären. Dabei ist auch der bekannte Privatdetektiv Benoit Blanc anwesend, der von einer ihm unbekannten Person beauftragt wurde, sich des Falles anzunehmen. Infolgedessen befragen die drei alle Angehörigen über die Geburtstagsparty am Abend vor Harlans Tod und über besondere Vorkommnisse in der darauffolgenden Tatnacht.